众多研究表明，冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是一种 多基因遗传病。长期以来，临床上发现同样是动脉粥样硬化(AS)患者发生心、脑血管合并症的机会悬殊很大，而且在对调脂药物的治疗反应上，个体之间也存在很大差异。研究发现，这些现象与多基因变异影响血脂代谢、血栓形成及血管收缩与舒张等病理生理过程有关。各种载脂蛋白(Apo)、脂蛋白受体和脂质转运蛋白和酶基因多态性(gene polymorphism)为研究冠心病的发生、发展及临床诊治开辟了一个新的领域。

　　一、基因多态性

　　多态性(polymorphism)是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或 基因型(genotype)或等位基因(allele)，亦称遗传多态性(genetic polymorphism)或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生源于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。冠心病这类多基因遗传病是多个遗传因素影响不同的易感基因或/ 和同一易感基因的一个以上相关位点以及与后天环境因素共同作用的结果，在正常人群中亦存在这些基因变异。患病群体和非患病群体间只是 基因频率(gene frequency)上的差异。基因多态性不仅可用于经典的遗传分析(遗传病的基因诊断和连锁分析)，还可用于疾病的关联分析、疾病相关基因的定位、法医学的个体识别与亲权鉴定、疾病发生的分子遗传机理的阐明、环境因素易感基因的检出以及药物基因组学中指导用药和药物设计等。

　　人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异。通常分为3大类：

　　⑴限制性片段长度多态性(RFLP)，即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。这是一类比较普遍的多态性。

　　⑵DNA重复序列的多态性，特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，并主要表现于重复序列拷贝数的变异。小卫星(minisatallite)DNA由15~65bp的基本单位串联而成，总长通常不超过20kb，重复次数在人群中是高度变异的。这种可变数目串联重复序列(VNTR)决定了小卫星DNA长度的多态性，如apoB基因3'端高变区(HVR)由长15bp富含A-T的不同拷贝数的串联重复序列组成。微卫星(microsatallite)DNA的基本序列只有1~8bp，而且通常只重复10~60次。如apo(a)基因存在着由(TTTTA)n组成的重复序列。

　　⑶单核苷酸多态性(SNP)，即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，这是目前倍受关注的一类多态性。SNP通常是一种双等位基因的(biallelic)，或二态的变异。作为一种碱基的替换，SNP大多数为转换，特别在CG序列上出现最为频繁。据估计，单碱基变异的发生频率在1‰~2‰。如假定1/1000的碱基是多态的话，人类30亿碱基中当有约三百万个SNP位点，它们绝大多数位于非编码区。SNP在基因组中数量巨大，分布频密，而且其检测易于自动化和批量化，因而被认为是新一代的遗传标记。

　　二、 基因多态性的研究方法

　　理想的基因多态性研究方法应该具有灵敏度高、简便、快速、准确且经济实用等优点。RFLP的检测多用Southern印迹杂交法或用限制性内切酶识别消化结合电泳的方法。但由于所检测突变范围窄，可进一步结合聚合酶链反应(PCR)扩大RFLP的使用范围(即用PCR-RFLP法)。通常应根据基因变异的类型采用不同的分析方法，如基因缺失可用基因探针杂交，PCR扩增直接检测。点突变可用单链构象多态性(SSCP)、放大受阻突变系统(ARMS)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交、扩增片段长度多态性(AFLP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、ASO引物PCR、DNA测序等直接检查。小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性多通过PCR直接扩增其所在区域，然后用电泳分析测定。也可以直接测序来判断小卫星DNA和微卫星DNA重复单位的拷贝数。原则上任何用于检测上述2类多态性标记的技术都可用于SNP的识别或检出。例如RFLP法、ASO探针杂交、寡核苷酸连接测定(OLA)、ARMS、DNA测序等。近年来又相继报道一些新的基因多态性研究方法，如变性高效液相色谱(DHPLC)技术、荧光定量PCR技术(TaqMan PCR)、侵入检测技术(invader assay)、Snapshot、分子灯塔技术(molecular beacon)、 基因芯片(DNA芯片)等。

　　以apoE基因多态性为例，目前应用较多的主要有3种研究方法：

　　⑴ASO引物PCR法：设计5种引物D、E、F、G和H，可编码apoE基因第4外显子区299个氨基酸的基因序列。其中引物H为公共引物，分别与引物D、E、F和G配对扩增，在同一个反应管内进行PCR反应。确认一份样品的基因型需进行4次反应，引物D决定112位精氨酸(Arg)，引物E决定112位半胱氨酸(Cys)，引物F决定158位Arg，引物G决定158位Cys。

　　⑵PCR-RFLP：设计一对引物特异性扩增apoE基因第4外显子区含编码112位与158位氨基酸的基因序列，扩增产物经HhaI酶切后电泳染色分析，即可检测出6种apoE基因型。

　　⑶双反应体系ARMS快速分型法：设计5条引物, P1和P2分别检测158位Cys和Arg;P3和P4分别检测112位Cys和Arg;P5为公共引物。分别组成两个体系，A体系和B体系，其中A体系中加入了P1, P3;B 体系中加入了P2, P4。根据扩增反应结果即可判定基因型。目前最常用的方法为后两种。 第一页 1 2 3 下一页 最后一页